Гибридизация нуклеиновых кислот егэ

в условии
в решении
в тексте к заданию
в атрибутах

Категория:

Атрибут:

Всего: 479    … 281–300 | 301–320 | 321–340 | 341–360 | 361–380 | 381–400 | 401–420 | 421–440 …

Добавить в вариант

Всего: 479    … 281–300 | 301–320 | 321–340 | 341–360 | 361–380 | 381–400 | 401–420 | 421–440 …

Гибридизация
нуклеиновых кислот

Вторичная
структура нуклеиновых кислот образуется
за счёт слабых взаимодействий — водородных
и гидрофобных. Поэтому если водный
раствор ДНК нагреть до 100 °С, то связи,
удерживающие две цепи двойной спирали
вместе, разрушаются. В результате разрыва
водородных и гидрофобных связей цепи
ДНК расходятся. Этот процесс
называют «денатурация». Однако
если раствор, содержащий денатурированную
ДНК, очень медленно охлаждать, то могут
получиться двухспиральные структуры,
идентичные исходным. Такой процесс
получил название «ренативация».

На
явлении денатурации и ренативации
основан метод, называемый «молекулярная
гибридизация». Процесс
гибридизации может осуществляться
между двумя любыми цепями нуклеиновых
кислот (ДНК-ДНК, ДНК-РНК) при условии,
что они содержат комплементарные
последовательности нуклеотидов. Такие
гибридные структуры можно выделить
центрифугированием в градиенте плотности
сахарозы или наблюдать в электронном
микроскопе.

Если
раствор, содержащий образцы ДНК 1 и 2,
выделенные из организмов разных видов,
денатурировать, а затем провести
ренатива-цию, то образуются двухспиральные
структуры. Но наряду с исходными ДНК 1
и ДНК 2 образуются гибридные двойные
спирали, содержащие цепь ДНК образца 1
и цепь ДНК образца 2, где присутствуют
как спирализо-ванные, так и неспирализованные
участки. В неспирализованных участках
фрагменты цепей ДНК не комплементарны,
т.е. в ходе гибридизации получаются
несовершенные гибриды. Методом
молекулярной гибридизации можно
установить:

сходство
и различие первичной структуры разных
образцов нуклеиновых кислот;

различие
ДНК, выделенных из организмов разных
видов;

идентичность
ДНК всех органов и тканей одного
организма.

При
проведении гибридизации ДНК-РНК были
выделены гибридные молекулы, содержащие
одну цепь ДНК и одну цепь РНК. Если для
эксперимента были взяты ДНК и РНК
(первичный транскрипт), выделенные из
одного организма, то образовывались
совершенные гибриды, потому что молекула
РНК комплементарна цепи ДНК. Гибридизацией
ДНК-РНК было впервые установлено, что
все виды РНК клетки имеют на молекуле
ДНК комплементарные участки.

Рис.
4-13. Гибридизация нуклеиновых кислот. А
— гибридизация ДНК-ДНК; Б — гибридизация
ДНК-РНК.

Первоначально
классическим методом выявления вирусного
генома считался высокоспецифичный
метод гибридизации НК, но в настоящее
время все шире используется выделение
геномов вируса с помощью полимеразной
цепной реакции (ПЦР).

Молекулярная
гибридизация нуклеиновых кислот. Метод
основан на гибридизации комплементарных
нитей ДНК или РНК с образованием
двунитевых структур и на выявлении их
с помощью метки. Для этой цели используются
специальные ДНК- или РНК-зонды, меченные
изотопом (³²Р)
или биотином, обнаруживающие комплементарные
нити ДНК или РНК. Существуют несколько
вариантов метода:
– точечная
гибридизация – выделенную и денатурированную
НК наносят на фильтры и затем добавляют
меченый зонд; индикация результатов –
авторадиография при использовании ³²Р
или окраска – при
авидин-биотине;
– блот-гибридизация
– метод выделения фрагментов НК,
нарезанных рестрикционными эндонуклеазами
из суммарной ДНК и перенесенных на
нитроцеллюлозные фильтры и тестируемые
мечеными зондами; используется как
подтверждающий тест при ВИЧ
инфекции;
– гибридизация in
situ –
позволяет определять НК в инфицированных
клетках [7].

ПЦР основана
на принципе естественной репликации
ДНК. Суть метода заключается в многократном
повторении циклов синтеза (амплификации)
вирусспецифической последовательности
ДНК с помощью термостабильной Taq
ДНК-полимеразы и двух специфических
затравок – так называемых праймеров.

Каждый
цикл состоит из трех стадий с различным
температурным режимом. В каждом цикле
удваивается число копий синтезируемого
участка. Вновь синтезированные фрагменты
ДНК служат в качестве матрицы для синтеза
новых нитей в следующем цикле амплификации,
что позволяет за 25–35 циклов наработать
достаточное число копий выбранного
участка ДНК для ее определения, как
правило, с помощью электрофореза в
агарозном геле.

Метод
высокоспецифичен и очень чувствителен.
Он позволяет обнаружить несколько копий
вирусной ДНК в исследуемом материале.
В последние годы ПЦР находит все более
широкое применение для диагностики и
мониторинга вирусных инфекций (вирусы
гепатитов, герпеса, цитомегалии, папилломы
и др.) [8,9].

Разработан
вариант количественной ПЦР, позволяющий
определять число копий амплифицированного
сайта ДНК. Методика проведения сложна,
дорогостояща и пока недостаточно
унифицирована для рутинного применения.

28.
Третичная структура ДНК. Роль гистоновых
и негистоновых белков в компактизации
ДНК. Организация хроматина. Ковалентная
модификация гистонов и ее роль в регуляции
структуры и активности хроматина.

Каждая
молекула ДНК упакована в отдельную
хромосому. В диплоидных клетках человека
содержится 46
хромосом. Общая
длина ДНК всех хромосом клетки составляет
1,74 м, но она упакована в ядре, диаметр
которого в миллионы раз меньше. Чтобы
расположить ДНК в ядре клетки, должна
быть сформирована очень компактная
структура. Компактизация и суперспирализация
ДНК осуществляются с помощью разнообразных
белков, взаимодействующих с определёнными
последовательностями в структуре ДНК.
Все связывающиеся с ДНК эукариотов
белки можно разделить на 2 группы: гисгоновые
и негистоновые белки. Комплекс
белков с ядерной ДНК клеток называют
хроматином.

Гистоны —
белки с молекулярной массой 11-21 кД,
содержащие много остатков аргинина и
лизина. Благодаря положительному заряду
гистоны образуют ионные связи с
отрицательно заряженными фосфатными
группами, расположенными на внешней
стороне двойной спирали ДНК.

Существует
5 типов гистонов. Четыре гистона Н2А,
Н2В, НЗ и Н4 образуют октамерный белковый
комплекс (Н2А, Н2В, НЗ, Н4)₂,
который называют «нуклеосомный
кор» (от
англ. nucleosome
core).
Молекула ДНК «накручивается» на
поверхность гистонового октамера,
совершая 1,75 оборота (около 146 пар
нуклеоти-дов). Такой комплекс гистоновых
белков с ДНК служит основной структурной
единицей хроматина, её называют «нуклеосома». ДНК,
связывающую нуклеосомные частицы,
называют линкерной ДНК. В среднем
линкерная ДНК составляет 60 пар нуклеотидных
остатков. Молекулы гистона H1 связываются
с ДНК в межнуклеосомных участках
(линкерных последовательностях) и
защищают эти участки от действия нуклеаз.

В
ядре каждой клетки присутствует около
60 млн молекул каждого типа гистонов, а
общая масса гистонов примерно равна
содержанию ДНК. Аминокислотные остатки
лизина, аргинина и концевые аминогруппы
гистонов могут модифицироваться:
ацетилироваться, фосфорилироваться,
метилироваться или взаимодействовать
с белком убиквитином (негистоновый
белок). Модификации бывают обратимыми
и необратимыми, они изменяют заряд и
конформацию гистонов, а это влияет на
взаимодействие гистонов между собой и
с ДНК. Активность ферментов, ответственных
за модификации, регулируется и зависит
от стадии клеточного цикла. Модификации
делают возможными конформационные
перестройки хроматина.

Негистоновые
белки хроматина

В
ядре эукариотической клетки присутствуют
сотни самых разнообразных ДНК-связывающих
негистоновых белков. Каждый белок
комплементарен определённой
последовательности нуклео-тидов
ДНК (сайт
ДНК). К
этой группе относят семейство
сайт-специфических белков типа «цинковые
пальцы. Каждый «цинковый палец»
узнаёт определённый сайт, состоящий из
5 нуклеотидных пар. Другое семейство
сайт-специфических белков — гомодимеры.
Фрагмент такого белка, контактирующий
с ДНК, имеет структуру «спираль-поворот-спираль».
К группе структурных и регуляторных
белков, которые постоянно ассоциированы
с хроматином, относят белки высокой
подвижности (HMG-белки —
от англ, high
mobility gel proteins).
Они имеют молекулярную массу менее 30
кД и характеризуются высоким содержанием
заряженных аминокислот. Благодаря
небольшой молекулярной массе HMG-белки
обладают высокой подвижностью при
электрофорезе в полиакриламидном геле.
К негистоновым белкам принадлежат также
ферменты репликации, транскрипции и
репарации. При участии структурных,
регуляторных белков и ферментов,
участвующих в синтезе ДНК и РНК, нить
нуклео-сом преобразуется в
высококонденсированный комплекс белков
и ДНК. Образованная структура в 10 000 раз
короче исходной молекулы ДНК.

Соседние файлы в папке Всякое

• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #

Нуклеиновые кислоты — это биополимеры, мономерами которых являются нуклеотиды. В настоящее время известно два типа нуклеиновых кислот: рибонуклеиновая (РНК) и дезоксирибонуклеиновая (ДНК).

Нуклеотид образован азотистым основанием, остатком сахара-пентозы и остатком ортофосфорной кислоты. Особенности нуклеотидов в основном определяются азотистыми основаниями, входящими в их состав, поэтому даже условно нуклеотиды обозначаются по первым буквам их названий. В состав нуклеотидов могут входить пять азотистых оснований: аденин (А), гуанин (Г), тимин (Т), урацил (У) и цитозин (Ц). Пентозы нуклеотидов — рибоза и дезоксирибоза — определяют, какой нуклеотид будет образован — рибонуклеотид или дезоксирибонуклеотид. Рибонуклеотиды являются мономерами РНК, могут выступать в качестве сигнальных молекул (цАМФ) и входить в состав макроэргических соединений, например АТФ, и коферментов, таких как НАДФ, НАД, ФАД и др., а дезоксирибонуклеотиды входят в состав ДНК.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — двухцепочечный биополимер, мономерами которого являются дезоксирибонуклеотиды. В состав дезоксирибонуклеотидов входят только четыре азотистых основания из пяти возможных — аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г) или цитозин (Ц), а также остатки дезоксирибозы и ортофосфорной кислоты. Нуклеотиды в цепи ДНК соединяются между собой через остатки ортофосфорной кислоты, образуя фосфодиэфирную связь. При образовании двухцепочечной молекулы азотистые основания направлены вовнутрь молекулы. Однако соединение цепей ДНК происходит не случайным образом — азотистые основания разных цепей соединяются между собой водородными связями по принципу комплементарности: аденин соединяется с тимином двумя водородными связями (А=Т), а гуанин с цитозином — тремя (Г$≡$Ц).

Для нее были установлены правила Чаргаффа:

1. Количество нуклеотидов ДНК, содержащих аденин, равно количеству нуклеотидов, содержащих тимин (А=Т).
2. Количество нуклеотидов ДНК, содержащих гуанин, равно количеству нуклеотидов, содержащих цитозин (Г$≡$Ц).
3. Сумма дезоксирибонуклеотидов, содержащих аденин и гуанин, равна сумме дезоксирибонуклеотидов, содержащих тимин и цитозин (А+Г = Т+Ц).
4. Отношение суммы дезоксирибонуклеотидов, содержащих аденин и тимин, к сумме дезоксирибонуклеотидов, содержащих гуанин и цитозин, зависит от вида организмов.

Структура ДНК была расшифрована Ф. Криком и Д. Уотсоном (Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1962 г.). Согласно их модели, молекула ДНК представляет собой правозакрученную двойную спираль. Расстояние между нуклеотидами в цепи ДНК равно 0.34 нм.

Важнейшим свойством ДНК является способность к репликации (самоудвоению). Основной функцией ДНК является хранение и передача наследственной информации, которая записана в виде последовательностей нуклеотидов. Стабильность молекулы ДНК поддерживается за счет мощных систем репарации (восстановления), но даже они не способны полностью устранить неблагоприятные влияния, что в конечном итоге приводит к возникновению мутаций. ДНК эукариотических клеток сосредоточена в ядре, митохондриях и пластидах, а прокариотических — находится прямо в цитоплазме. Ядерная ДНК является основой хромосом, она представлена незамкнутыми молекулами. ДНК митохондрий, пластид и прокариот имеет кольцевую форму.

Рибонуклеиновая кислота (РНК) — биополимер, мономерами которого являются рибонуклеотиды. Они содержат также четыре азотистых основания — аденин (А), урацил (У), гуанин (Г) или цитозин (Ц), отличаясь тем самым от ДНК по одному из оснований (вместо тимина в РНК встречается урацил). Остаток сахара-пентозы в рибонуклеотидах представлен рибозой. РНК — в основном одноцепочечные молекулы, за исключением некоторых вирусных. Выделяют три основных типа РНК: информационные, или матричные (иРНК, мРНК), рибосомальные (рРНК) и транспортные (тРНК). Все они образуются в процессе транскрипции — переписывания с молекул ДНК.

иРНК составляют наименьшую фракцию РНК в клетке (2– 4 %), что компенсируется их разнообразием, так как в одной клетке могут содержаться тысячи различных иРНК. Это одноцепочечные молекулы, являющиеся матрицами для синтеза полипептидных цепей. Информация о структуре белка записана в них в виде последовательностей нуклеотидов, причем каждую аминокислоту кодирует триплет нуклеотидов — кодон.

рРНК представляют собой наиболее многочисленный тип РНК в клетке (до 80 %). Их молекулярная масса составляет в среднем 3000–5000; образуются в ядрышках и входят в состав клеточных органоидов — рибосом. рРНК, по-видимому, также играют определенную роль в процессе синтеза белка.

тРНК — наименьшие из молекул РНК, так как содержат всего 73–85 нуклеотидов. Их доля от общего количества РНК клетки составляет около 16 %. Функция тРНК — транспорт аминокислот к месту синтеза белка (на рибосомы). По форме молекулы тРНК напоминают листок клевера. На одном из концов молекулы находится участок для прикрепления аминокислоты, а в одной из петель — триплет нуклеотидов, комплементарный кодону иРНК и определяющий, какую именно аминокислоту будет переносить тРНК — антикодон.

Все типы РНК принимают активное участие в процессе реализации наследственной информации, которая с ДНК переписывается на иРНК, а на последней осуществляется синтез белка. тРНК в процессе синтеза белка доставляет аминокислоты к рибосомам, а рРНК входит в состав непосредственно рибосом.

Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ) — это нуклеотид, содержащий, помимо азотистого основания аденина и остатка рибозы, три остатка фосфорной кислоты. Связи между двумя последними фосфорными остатками — макроэргические (при расщеплении выделяется 42 кДж/моль энергии), тогда как стандартная химическая связь при расщеплении дает 12 кДж/моль. При необходимости в энергии макроэргическая связь АТФ расщепляется, образуются аденозиндифосфорная кислота (АДФ), фосфорный остаток и выделяется энергия:

АТФ + Н₂О $→$ АДФ + H₃PO₄ + 42 кДж.

АДФ также может расщепляться с образованием АМФ (аденозинмонофосфорной кислоты) и остатка фосфорной кислоты:

АДФ + Н₂О $→$ АМФ + H₃PO₄ + 42 кДж.

В процессе энергетического обмена (при дыхании, брожении), а также в процессе фотосинтеза АДФ присоединяет фосфорный остаток и превращается в АТФ. Реакция восстановления АТФ называется фосфорилированием. АТФ является универсальным источником энергии для всех процессов жизнедеятельности живых организмов.

Изучение химического состава клеток всех живых организмов показало, что они содержат одни и те же химические элементы, химические вещества, выполняющие одинаковые функции. Более того, участок ДНК, перенесенный из одного организма в другой, будет в нем работать, а белок, синтезированный бактериями или грибами, будет выполнять функции гормона или фермента в организме человека. Это является одним из доказательств единства происхождения органического мира.

Скачать материал

Скачать материал